Western blotting(西方墨點法)的免疫檢驗方法,是可以強力偵測一細胞或體液中特定的微量蛋白質,這項技術是結合膠體電泳(gel electrophoresis)的優越解析力、抗體的專一性、enzyme的敏感性。如此一來,使得在一複合物中,海底撈針地找尋一蛋白質,成為可能。

Western blotting又稱immunoblotting,主要分成三個步驟:

第一步,將蛋白質混合物置於SDS-polyacrylamide膠體上,電泳分離,接著是blotting:解析的蛋白質在電場中,從膠體轉移到Nitrocellulose transfer membrane。

第二步,將transfer membrane浸於含有標的蛋白質的抗體(primary antibody)溶液中,形成抗原-抗體複合體。

第三步,藉由對primary antibody具專一性的enzyme-linked抗體(secondary antibody),來漂洗此membrane,再加入受質,產生有色物質,而偵測得知感興趣蛋白質帶。

蛋白質的萃取

1. 將lysis buffer 300μl(內含protinase inhibitor)加入放置於4℃冰鎮之脊髓標本Ependrof tube,並以Microson機器打碎及sonication標本成均質液體,再用超高速離心方法(4℃下以65000至70000 rpm之速度,離心35分鐘);其後分離出上清液與沉澱物,丟棄沉澱物,留下上清液。

2. 此上清液(含蛋白質),以modified Bradford method定量蛋白質含量(以Bio-Tek Elx800分析吸光值,來測定各標本之蛋白質量)。

3. 將經校訂後取等體積與等蛋白質總量之標本(50或100μl),置入sample collecting tubes內,再加入同體積的Tricine SDS sample buffer,於95℃下加熱15分鐘後,於4℃下離心(7000rpm),等待應用loading在SDS-PAGE gel上。

Tricine Sodium Dodecyl Sulfate(SDS)膠體之準備

1. 配置7﹪的分離膠體(separation gel for NOS):將30﹪Acrylamide solution 3.5ml,DDW 1.5ml,3M pH8.45 Tris –HCl 5ml,40﹪glycerol 5ml,10﹪Ammonium persulfate 75μl及TEMED 7.5μl混合均勻後;立即注入注膠器之玻璃板間,並於其上層注入100﹪酒精,使其表面平整,靜置至膠體硬化後,再將上層酒精倒出吸乾。

2. 配置10﹪的分離膠體(separation gel for COX-2):將30﹪Acrylamide solution 5ml,3M pH8.45 Tris –HCl 5ml,40﹪glycerol 5ml,10﹪Ammonium persulfate 75μl及TEMED 7.5μl混合均勻後;立即注入注膠器之玻璃板間,並於其上層注入100﹪酒精,使其表面平整,靜置至膠體硬化後,再將上層酒精倒出吸乾。

3. 再注入配置好的5﹪聚積膠體(Stacking Gel:30﹪Acrylamide solution 0.5ml,3M pH 8.45 Tris –HCl 1.25ml,DDW 2ml,10﹪Ammonium persulfate 25μl及TEMED 5μl),於分離膠體上層,迅速插入0.75mm,10 wells之comb,來製備樣品槽,之後靜置至膠體凝固。

4. 完全聚合後,小心將comb拔出,再將sandwich clamp assemblies放入電泳槽中,加入10X Tricine SDS/electrophoresis buffer(Tris base 121g,Tricine 179g,SDS 10g,add DDW to final 1000ml),觀察無洩漏情況後,即完成膠體與電泳槽之製備。

加入樣本(Loading sample)及電泳

1. 樣品槽由左至右,依序注入已染色之分子量標定蛋白質(pre-stained molecular weight marker),及其餘製備之脊髓樣本液,以進行電泳。

2. Tricine SDS/electrophoresis buffer solution要加入電泳槽內,先倒入正極槽,再倒入負極槽,注意不要有氣泡黏在膠體上。

3. 電壓在前十分鐘(聚積層)用80 volts,帶樣本移動到分離層再調高到125 volts。

4. 待tracking dye跑超出底層並且marker可看到呈現(210、105與70Kd清楚的分開),此時關掉電源,結束電泳,隨即拆除電泳儀組,小心取出膠體,浸入TTBS(Tris-Tween buffer saline)約一分鐘之後,進行轉印(electrotransfer)步驟。

轉印(electrotransfer)步驟

1. 先將nitrocellulose(NC)paper(transfer membrane)及3M濾紙浸泡於轉印緩衝液(pH10.4,Transfer buffer:CAPS 2.2g、methanol 200ml、DDW 800ml)中,直到紙之各部分均勻潤濕為止。

2. Electrotransfer的方向是由負極(anode)到正極(cathode),而NC paper要置於接近正極,膠體那一面向負極。

3. 將已浸濕的3M濾紙,整齊重疊至於半乾式電轉漬器中間,為最底層。再平舖膠體於濾紙之上,並將NC paper蓋在膠體上,最上層再舖上3M濾紙,最後蓋上蓋子。接上電源,維持電流130mA,轉印overnight(至少14至15小時)

免疫轉漬法(immunoblotting)

1. 轉印完成後,將NC paper置於3﹪Blot-Quick blocking solution中,用迴旋振盪器振盪三十分鐘blocking。

2. 加入初級抗體(COX-2與nNOS antibody),用迴旋振盪器振盪作用二至三小時。

3. 以TTBS(Tris-Tween buffer saline)強力振盪洗三次,每次八分鐘。再將transfer membrane置於3﹪Blot-Quick blocking solution中,用迴旋振盪器振盪三十分鐘blocking。再加入次級抗體(1:500 polyclonal anti-rabbit IgG for COX-2,monoclonal anti-mouse IgG for nNOS),作用50分鐘。

4. 之後以TTBS強力振盪洗三次,每次八分鐘。

5. 再將transfer membrane夾起蔭乾,置入chemiluminescence reagents(PerkinElmer Life Science;Western Lightning:Enhanced luminol reagent 1.5ml配上Oxidizing reagent 1.5ml)作用3分鐘反應螢光。

6. 最後以Kodak之X-ray壓片,洗片後觀察結果。

摘至http://ppcg.myweb.hinet.net/Western%20blotting.htm

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