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流式細胞儀 細胞週期染色(flow cytometry propidium iodide stain)

在細胞凋亡的早期,發現有染色體濃縮 (chromosome condensation)的情況,染色質會聚集成半月狀沿著核膜周圍分佈,以及出現細胞核萎縮 (pyknosis); 晚期時細胞膜皺褶、失去原有細胞骨架但胞器仍在,胞膜及胞漿保持完整,去氧核糖核酸 (DNA)會斷裂成特定大小片段 (180-200 base pair) ,以及有凋亡小體 (apoptosis bodies)的產生,最後被鄰近的細胞清除。propidium iodide是一種染劑,中文名为碘化丙啶。能夠插入DNA或RNA鹼基對中並在受到488 nm激發後放出在562-588 nm間波長的激發光,因此我們可以利用這種特性去針對那些正在凋亡或染色體受損斷裂的細胞做標定並偵測它的含量。

材料和方法
1. 待測細胞固定染色方法如下(酒精固定法及PI 染色法):
(1) 置備懸浮細胞液,調整至濃度約5x 10^6 cells/ml。若細胞株為attached cell line,先以 Trypsin 將細胞
打下,再調整濃度(注意Trypsin 處理不可過度)。
(2) 取 1ml 細胞液,以冰冷的 PBS buffer 清洗細胞一次,離心後,去除上清液。
(3) 以剩餘的上清液將細胞打散(必須確定細胞完全打散)。
(4) 在震盪器上(轉速不可開太快)一邊震盪一邊逐一滴入3ml 70% 冰冷的酒精(注意觀察細胞,不要讓
細胞發生 aggregate 現象)。
(5) 置於-20 度固定至少一小時。
(6) 染色前,將細胞從 -20 度取出,以 300g 離心5 分鐘,去除上清液。
(7) 以剩餘的上清液將細胞打散,加入 5ml PBS buffer,靜置 3 分鐘後離心,去除上清液。
(8) 重複步驟7,以5ml PBS buffer 再清洗細胞一次。
(9) 加入 1ml PI/Triton X-100(終濃度 PI= 20ug/ml, Triton-X 100=0.1%, RNase A= 0.2mg/ml),均勻打散細
胞,避光染色至少30 分鐘。
(10) 上機前打散細胞並以 35um 尼龍篩網過濾樣本。
2. 陽性控制組(已經固定而且以PI 染色的健康細胞)
儀器設定
1. 參數選擇
要選擇的參數有:FS Lin、SS Lin、FL Lin、FL Peak、Ratio(Ratio= FL Peak/ FL Lin)
2. 門檻值設定
門檻值可設在FS 或FL
3. 分析圖形
對動物細胞進行分析,先利用陽性控制組細胞調整設定及繪圖。第一張要看的圖就是FS Lin- SS
Lin,先調整FS、SS 電壓及Gain 值,使細胞群落在FS Lin- SS Lin 圖形中央,圈選所要觀察的細胞群,
於 FL Lin- Ratio、FL Lin- FL Peak 圖形調整FL 電壓及Gain 值設定,區分螢光來源是單顆細胞還是聚集黏
在一起的細胞(與基因組及倍體數分析的方法相同)。在FL Lin- Ratio 或FL Lin- FL Peak 圈選單顆細
胞,於FL Lin histogram 分析單顆細胞的螢光訊號。

參考 http://ipmb.sinica.edu.tw/flowservice/ch/document/Protocol_%20Cell%20Cycle.pdf

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